分子光谱法紫外/可见分子吸收光谱的可追溯性技术原理：紫外和可见光谱区的分子吸收光谱，通常称为“UV/vis”，是最古老和最成熟的化学分析仪器方法之一，光电检测分光光度计···
全国咨询热线
技术原理：紫外和可见光谱区的分子吸收光谱，通常称为“UV/vis”，是最古老和最成熟的化学分析仪器方法之一，光电检测分光光度计的发展可追溯到1920年代。关于这种成熟技术的仪器和应用已经写了很多书籍和评论文章。因此，本节只涉及与确保在适用范围内的测量不确定性水平上可追溯测量相关的基本技术，或“适用性”。
分子吸收光谱的基本测量是样品的吸光度（A），定义为：
其中分子中对数的分子是给定波长（λ）处的入射光强度，分母是样品后减弱的同一分布的强度 。
范围：已知浓度的纯化合物在透明溶剂中的吸光度光谱（A与λ的函数图）是该化合物（有时也是溶剂）的特征，可用于定性和定量分析。化合物通常通过光谱中主要吸收带的波长和吸光度（每单位浓度和路径长度的吸光度）来表征。吸收化合物的混合物在定量过程中容易出现光谱干扰错误，因为吸收带往往比较宽。避免这些错误的分离和其他化学方法超出了本文的范围 。
样品性质：UV/vis分析的主要样品要求是至少在200 nm至700 nm范围内对光学辐射部分透明。同质的、清澈的溶液是UV/vis分析中最常见的样品形式，但这种溶液不一定是液体，玻璃、聚合物混合物和透明基板上的薄膜材料也常常被测量。含有分散颗粒的样品在UV/vis测量中容易出问题，因为颗粒会反射和散射入射光，产生光度误差 。
定性分析：UV/vis可以定性地确定样品中成分的存在与否；然而，大多数样品的宽吸收带通常限制了这种方法的实用性。材料的UV/vis光谱结合其发光和反射光谱决定了材料的颜色外观。光谱学的这一方面通常被称为颜色科学，具有巨大的商业实用性和影响，并且已经演变成一个几乎与光谱学分离的领域，主要致力于基于光谱的材料定量分析 。
吸光度标度基于两个强度的比值（见公式4.1），精确度要求波长选择装置和光电检测器的组合产生的信号（S）与光强度（I）成正比。实际上，允许背景（B）和强度依赖的信号与强度的比例关系（k(I)），我们可以得到：
当不存在暗电流或杂散辐射能量（SRE）（即B=0）且光强度与检测器信号之间的比例关系为常数时，方程（4.2）可以化简为所需的比值I_0/I。大多数研究级分光光度计设计为在有用的分析范围内使这些偏差源变得可以忽略不计（0 ≤ A ≤ 3），并经常用作转移分光光度计，以提供具有可追溯性的吸光度校准或吸光度认证的参考材料，这些参考材料可追溯到国家计量研究院（NMI）维护的参考分光光度计，例如美国的国家标准与技术研究院（NIST）。用于常规测量的仪器也可能表现出可忽略的偏差，但通常会定期运行校准或认证的标准样品，以验证仪器的准确性，并为质量管理或法规要求提供记录 。
光度计参考材料的历史和发展，以及当前的建议，已经在英国紫外光谱组（UVSG）成立50周年纪念出版物中进行了详尽的讨论。尽管NMI多年来设计和分发了分光光度计认证参考材料（CRM），但当前适用性质量管理和跨国贸易的趋势更倾向于一个更分散的模型。通过国际标准化组织（ISO）定义的可追溯性概念，并得到NIST和其他NMI的认可，这种基础设施支持了将CRM生产推向私营部门的发展。CRM生产者可以通过严格的文件记录，声称符合“比较链条不间断且所有不确定性均已说明”的要求，来声明其认证值的可追溯性 。
ISO Guide 34为CRM的生产提供了详细框架。实验室根据此指南获得的生产指定CRM的认证，被ISO认可为宣称这些材料的认证值具有可追溯性的必要和充分条件。同样，ISO Guide 17025赋予了对客户提供的标准样品进行吸光度和波长校准测量的可追溯性 。
技术原理：荧光/磷光光谱是研究化学物质吸收光后发射的紫外、可见和近红外（NIR）光。光的吸收使物质进入电子激发态。发射波长通常比激发波长更长或能量更低。荧光光谱仪或荧光计用于测量发射光的强度与波长的关系。荧光和磷光是由光吸收激发的两种类型的发射。荧光的寿命较短（通常为1纳秒到10纳秒），通常由从激发单重态到基态的“允许”跃迁产生。磷光的寿命较长（通常为1毫秒到1秒），通常由从激发三重态到基态的“禁戒”跃迁产生。具有几百纳秒到几百微秒寿命的发射并不少见，可能同时具有荧光和磷光的特征。荧光在相似条件下通常比磷光更强。为了简洁和空间考虑，下面仅讨论荧光检测，但其中许多内容也适用于磷光 。
范围和定性分析：荧光光谱是一种“无背景”技术，意味着如果样品不发荧光，则测量信号应为零（信号的下限）。信号的上限未明确定义，使得荧光强度难以表达为独立于仪器几何和激发强度的标度（荧光强度依赖于激发强度、吸收系数、浓度、量子产率、样品几何、仪器几何和检测系统响应）。这与吸光光谱法不同，在吸光光谱法中，透射率是样品透射光强度与入射光强度的比值，后者是上限。由于难以定义荧光强度标度，很少有人尝试比较不同仪器或同一仪器在长时间内测量的荧光强度。荧光光谱主要用于确定未知样品中特定物质的存在与否。使用该技术定量分析时，通常通过荧光强度与浓度的校准曲线实现，该曲线仅适用于获得该曲线的特定仪器和特定分析物。近年来，随着质量和法规标准的要求变得越来越严格，在许多使用荧光检测的关键领域，需要比较不同时间或不同仪器上测量的荧光强度和光谱轮廓 。
自1950年代第一批商业荧光计问世以来，低浓度荧光物质已经被检测出来。荧光检测的高灵敏度使得可以常规检测到纳摩尔浓度的荧光物质，并且在更困难的情况下可以检测到单个分子。过去，荧光光谱主要被视为一种研究技术，因为很少有天然化合物发荧光。然而，在过去10到15年中，合成了一长串荧光探针，这些探针专门与大量且多样的分析物结合。这一发展使荧光成为一种高度选择性的检测技术，从而扩大了其在广泛商业应用中的使用范围。荧光检测的强大灵敏度和选择性组合推动了近年来生物技术和药物发现的显著增长。荧光检测被用于绘制人类基因组，并用于绘制病毒和生物体的蛋白质和基因。制药公司也使用荧光检测在组合化学文库中筛选出有希望的药物“线索”，并在临床诊断中使用流式细胞术计数病变或对药物有反应的细胞相对数量。此外，荧光检测在环境监测中有重要应用，用于检测多环芳烃（PAHs）等污染物 。
样品性质：常规荧光计是一种台式仪器，具有一个光源（如氙灯）和用于激发的波长选择器、一个用于放置样品的样品仓以及用于发射的波长选择器和检测器。波长选择器通常是200 nm至800 nm范围内的单色仪。液体样品的荧光在激发光束相对于样品的90°角处测量，使用的矩形比色皿可容纳3 mL至4 mL。固体样品的荧光通常在激发光束的同一侧收集，角度小于90°。由于其低成本和现场使用的便利性，便携式荧光计越来越受欢迎。它们通常使用光栅将荧光分散到线性电荷耦合器件（CCD）阵列检测器上，光纤常用于将激发光传输到样品并从样品收集荧光。便携式荧光计的发射范围广，从200 nm到1100 nm，但使用灯、发光二极管（LED）或二极管激光器作为激发光源，没有波长选择装置。它们的灵敏度较低，光谱分辨率较低于台式仪器。高通量荧光计——微孔板和微阵列读取器——设计用于在短时间内测量大量样品。典型的样品密度为1536孔微孔板（12.8 cm×8.5 cm）和40,000点微阵列芯片（7.5 cm×2.5 cm）。微孔板读取器使用带通滤光器的灯进行激发，微阵列读取器使用单色激光。用于发射波长选择的滤光器带通为25 nm或更多 。
可追溯定量分析：荧光或荧光标记物质的定量分析通常通过首先绘制荧光强度与浓度的关系图，使用目标物质的标准溶液。这一关系图在低浓度下通常是线性的，因此可以拟合为直线函数。拟合函数可以用于通过测量未知溶液的荧光强度来确定其浓度，但这种校准曲线仅适用于获得曲线的特定仪器及其固定的仪器参数，并且仅适用于用于获得曲线的特定物质。此外，用于制备标准溶液的有机染料难以获得已知纯度，其荧光强度通常依赖于环境，因此它们作为荧光探针浓度定量标准的效果不理想。随着荧光测定变得越来越定量化，特别是在临床诊断和药物质量保证等受监管领域，确保不同仪器和实验室之间的荧光强度可比性至关重要。这要求荧光计经过严格校准 。
具有波长选择装置（如单色仪）的荧光计应首先校准发射和激发的波长和带宽精度。然后，应校准荧光强度随发射和/或激发波长的函数，具体取决于强度是作为一个或两个波长轴的函数进行测量。波长和带宽精度通常使用样品和/或光源位置的原子灯进行校准。水的拉曼线（斯托克斯位移3382 cm⁻¹）也可以用于校准一个波长轴，如果另一个轴已经校准 。
荧光强度随波长的函数，或光谱发射率，可以相对校准（光谱形状校准）或绝对校准（形状和绝对强度校准）。相对强度可以使用样品位置的校准光源或校准检测器，分别作为发射或激发波长的函数进行校准。绝对校准通常通过以下两种方式之一进行：使用样品位置的校准检测器，然后是校准反射器，或者使用样品位置的校准光源，然后是校准反射器。绝对校准产生一个随波长变化的强度校正因子，使得可以从测量的荧光光谱中确定荧光样品的双光谱发光辐亮度因子（BLRF）。BLRF定义为样品荧光的辐亮度与照射在样品上的激发辐照度的比值，随激发和发射波长的变化而变化。用BLRF表示的荧光光谱或强度称为“绝对”值，因为它不依赖于仪器，只依赖于样品。提供相对强度认证值或更好BLRF认证值的材料标准将大大简化校准过程，使非专家更容易、更便宜地校准其荧光计。几家国家计量研究院正在开发此类认证参考材料 。
技术原理：拉曼效应是指样品受到强单色光（通常是激光）照射时，所产生的非弹性散射光由于与化学样品的振动模式相互作用而发生频移。虽然原理上与红外光谱相似，但量子力学选择规则只选择那些使化学键的极化率成为拉曼活性的振动模式。散射效应的有效性直接依赖于极化率；极化率随着电子密度的增加或键长的减小而减小。因此，对称振动键伸展通常是拉曼活性的。
被测样品受到激光照射，产生的散射光用光谱仪测量。拉曼光谱仪可以是光栅型或傅里叶变换（FT）型。由于散射效率非常低，通常不到百万分之一，需要非常高效的滤光器将激光散射与拉曼光谱分离。全息消光滤光器的发明使得消光比可达10¹²，允许使用光学效率高的光谱仪与高量子效率的检测器相结合。最终结果是，拉曼光谱从一个严格的学术技术转变为一种实时、手提箱便携的分析技术 。
范围和样品性质：拉曼光谱适用于气体、液体和固体样品，并且已经开发了适用于微量样品和大宗化学样品的仪器。由于通常使用可见光和二极管激光，光纤采样变得越来越普遍，这促进了其在非传统地点的常规定性光谱中的使用。一个例子是制药公司在装载码头使用拉曼光谱来确保来料的身份。拉曼光谱主要是一种定性技术，即许多应用利用了每种化合物或化合物类别表现出的独特光谱。它适用于有机和无机材料的识别 。
拉曼光谱的优势在于其无损性且几乎不需要样品制备。其快速性使得纯化合物的光谱可以在几秒钟内获得。水的拉曼散射非常弱，与红外光谱不同，水样品可以用拉曼光谱测量。此外，拉曼光谱技术（相对于红外光谱）可以轻松测量非常低波数的振动模式。典型的商业分析系统允许测量到150 cm⁻¹，有些甚至低至4 cm⁻¹。而红外光谱最多只能测量到500 cm⁻¹。低频区域提供了关于晶体结构的详细信息，并且在制药行业中常用于多晶型鉴定 。
拉曼光谱的缺点是它是一种发射测量（单光束），因此光谱高度依赖于仪器。结果光谱是仪器响应（由于激光颜色、光学几何、光纤采样等因素）、样品的散射特性和化合物的“真实”拉曼光谱的卷积。由于这种卷积的复杂性，目前所有的拉曼光谱库都是仪器依赖的。不幸的是，从第一原理解释拉曼光谱对于非专业人士来说通常很困难。此外，拉曼光谱不是一种痕量定量分析技术。即使对于强散射样品，如苯，定量分析低于1%的质量分数也是困难的。这是由于测量的噪声特性和干扰。如果样品或其基质发生荧光，这种“噪声”比拉曼信号大几个数量级，可能使测量变得不可能。通过使用更长波长的激光可以部分缓解这种情况，但以牺牲灵敏度为代价。应该注意的是，基于显微镜的拉曼技术允许鉴定非常少量的纯物质。常规测量的有机物纳克量和化学气相沉积（CVD）在硅上的金刚石亚单层覆盖是半导体制造商的常规测量 。
定性分析：拉曼光谱主要是一种定性技术，用于通过其独特的光谱特征识别化合物。与红外光谱不同，拉曼光谱库不多见，因为其响应取决于仪器。现有的库通常只适用于单一激发波长，这些波长主要是操作在1064 nm的傅里叶变换（FT）拉曼系统。NIST正在生产一套人工标准，校正操作在各种商业重要激光激发波长下的拉曼光谱仪的相对强度轴。这将允许生产经过仪器校正的库，使其可用于不同系统 。
可追溯定量分析：拉曼光谱定量分析是一种增长中的实践，但与其用于定性分析相比仍然罕见。类似于基于吸光度的技术，拉曼发射散射与分析物的浓度成正比。标准添加法和内标法已被用于定量分析。然而，最近，多元统计技术在拉曼定量工作中变得越来越普遍。这种方法使用已知分析物浓度的光谱系列来“训练”校准模型。然后将未知样品的光谱与训练集进行比较，利用各种基于回归的统计技术。由于可以使用分析物的全光谱，这些方法有时可以获得比类似的单变量（比尔定律）校准更高的精度和更低的定量限 。
示例光谱：图1展示了环己烷的拉曼光谱。x轴是以拉曼位移单位表示的，表达为带的绝对波数频率与激发激光之间的差异。这种做法使光谱看起来类似于红外光谱。上图使用785 nm激光激发，未校正仪器响应。下图校正了仪器响应。可以看到，C-H伸缩区域（3300 cm⁻¹至2600 cm⁻¹）受系统响应的影响很大 。
拉曼光谱。上图:未校正的环己烷拉曼光谱，用于仪器响应;下:环己烷拉曼光谱校正仪器响应
技术原理：红外（IR）光谱区域从大约750 nm到300 μm，或以波数计大约从13,000 cm⁻¹到33 cm⁻¹。当辐射的频率与化学样品的振动模式匹配时，会在此光谱区域内被吸收。量子力学选择规则决定了只有那些分子在振动模式下发生偶极矩变化的模式才会在红外区域吸收。像Cl₂或N₂这样的同核线性分子的振动模式不显示净电荷分布的变化，因此不吸收红外光。含有杂原子取代基或具有非对称振动模式的分子由于净电荷密度变化而在红外区活跃。羰基就是一个例子。
在红外光谱中，被测样品用宽带红外光源照射，所得到的红外光谱由红外光谱仪测量。这些光谱仪可以是光栅型或傅里叶变换（FT）型，但在过去十年中，FT仪器几乎取代了色散系统，因为它们具有许多优点（速度、灵敏度、信噪比和成本）。由于红外光谱覆盖的波长/波数范围非常大，构成光谱仪的光学元件（如分光器、检测器灵敏度等）的材料限制，使得典型的红外光谱仪的范围从6000 cm⁻¹到660 cm⁻¹。这不被视为主要限制，因为该范围涵盖了大多数有机分子的全部基本振动模式空间 。
范围和样品性质：红外光谱适用于气体、液体和固体样品。已经开发了适用于微量样品和大宗化学样品的仪器。随着二维焦平面检测器的出现，化学成分的映射变得越来越普遍。成分映射在分析化学和病理学、法医学等健康相关领域有应用。
该技术的优势很多。由于吸光度的特性，其灵敏度高，微克量的纯物质可以通过良好的灵敏度进行测量。仪器相对便宜，非专业人员也可以轻松使用。由于该技术基于吸光度（基于透射比），所有光谱在所有光谱仪上看起来都一样，不像拉曼光谱等发射技术。因此，存在大量光谱库。专门的红外光谱库包括聚合物、药品、法医材料、药物、爆炸物、农药、化学战剂等——实际上，列表几乎是无尽的。事实上，有几个商业光谱库包含超过220,000个光谱。可以说，红外光谱是仅次于质谱的第二有用的识别技术，而且所需的样品制备更少。原则上，它对样品无损，并且已与其他分析技术配对以提供额外信息。例如，气相色谱-红外（GC-IR）和热重分析-红外（TGA-IR） 。
红外光谱的缺点在于化学键振动模式的高吸收率。纯化合物通常会完全吸收红外光谱的部分区域，除非通过样品的光路长度保持在100 μm以下。这需要使用昂贵且难以维护的光学池，其材料限于无机盐（如KBr或NaCl）或昂贵的半导体材料。常用的用于紫外/可见光、拉曼或荧光光谱的玻璃或石英不适用，因为它们完全吸收所有红外辐射。此外，由于相同的原因，水不能用作溶剂。水蒸气可能是一个显著干扰，需要用干燥的氮气对光谱仪进行吹扫。所有这些都需要显著的样品制备时间，并且操作员可能需要具备相当的技能 。
定性分析：红外光谱最常用于识别化学样品，因为化合物的红外光谱是其真正独特的物理特性之一。除了光学异构体外，没有两个化合物具有相同的红外光谱。如前所述，样品稀释/制备对于传统的透射测量可能是困难的。然而，一系列新的采样技术使得能够获得完整样品的红外光谱。衰减全反射利用挫折全内反射的原理控制对样品的穿透深度。容易实现1微米的样品路径长度，高度散射/吸收样品如布料、油甚至花生酱等食物都可以进行测量。新的聚四氟乙烯（PTFE，特氟龙）聚合物卡片允许将液体样品涂抹在一次性卡片上进行透射测量，消除了使用昂贵和精细盐窗的需要 。
可追溯定量分析：红外光谱可以用于定量分析，但与紫外/可见光透射测量相比，使用频率较低，因为保持样品和参考池相似的光程长度比较困难。所需的公差约为1微米或更小。当红外光谱用于定量分析时，通常使用内标或标准添加法将样品浓度与带面积（或高度）相关联。NIST生产一个适用于红外光谱的标准参考物质。SRM 1921是一个波长校准标准，适用于色散和傅里叶变换仪器 。
示例光谱：图2展示了苯的红外光谱 。
技术原理：当具有非零自旋量子数的核在均匀外部磁场中时，核电荷的自旋会产生一个磁偶极子，使其在外部磁场中排列成特定的方向。核的自旋量子数（I）决定了这些方向的数量（2I+1），它们之间的能量差为 ( B0hγ/2π )，其中 ( B0 ) 是体磁场强度， ( h ) 是普朗克常数， ( γ ) 是每种磁活性核的磁旋比常数。对于质子（1H），I等于1/2，因此有两个状态，在低能量状态下有一个轻微的超额人口。通过在拉莫尔频率或共振频率下施加射频辐射（RF），可以使低能量状态与高能量状态之间发生跃迁。在共振时，发生跃迁的核吸收RF能量，并被检测和测量。RF可以通过连续波（CW）扫描引入（保持体磁场恒定并扫描RF或反之亦然），也可以通过施加RF脉冲引入。在共振时，磁偶极子不仅从低能态跃迁到高能态，而且它们的自旋相位同步（相位对齐），建立净磁化。当共振条件被移除时，核自旋系统通过一级速率过程恢复到热力学正常状态。能态分布的恢复称为自旋-晶格弛豫，其速率常数为1/T1，而自旋去相机制称为自旋-自旋弛豫，其速率常数为1/T2 。
分子中每个相同核的磁环境通常略有不同，这取决于分子和电子配置，这导致了略有不同的共振频率，并形成了一个非常有用的化学位移标度，用于识别分子中的结构环境。此外，给定核的磁环境可以受其他邻近核的影响，导致能级的进一步分裂，这取决于相邻偶极子是对齐还是相反。这些分裂模式（或耦合）用于确定分子中最近邻核的数量和类型及其取向。不同类型核的共振频率通常分开很远（兆赫兹），而给定核的化学位移范围较小（千赫兹），分裂差异更小（赫兹） 。
现代NMR光谱仪使用超导电磁线圈提供体磁场。虽然这些仪器可以在CW模式下运行，但证明在RF脉冲提供（μs级别）下运行效率更高。这会同时激发所有的核，并在时间域（强度对时间）内数字化收集结果信号（自由感应衰减或FID），然后通过傅里叶变换转换为频率域（强度对频率）。通过收集和时间平均多个FID可以提高信噪比（S/N）。只要所有的核在脉冲之间完全弛豫，S/N会随着收集的FID数量的平方根增加而提高 。
范围：虽然有广泛的NMR活性核，但只有少数被常规使用。幸运的是，有机分子中最常见的原子的同位素在此范围内。1H是最常观察到的核，因为它具有较大的天然丰度和高相对灵敏度。表1展示了其他常用核 。
样品性质：高分辨率NMR光谱通常从液体样品或溶液中的材料中收集。样品量从微克到几百毫克不等。固体样品也可以获得NMR光谱。然而，需要使用特殊技术，如快速旋转样品，使其轴特定地取向于体磁场（在“魔角”），以缩小谱线宽度。NMR过程是非破坏性的，因此样品可以回收。为了避免干扰，通常使用不含被观察核的溶剂。对于1H NMR，常用氘代溶剂。氘核的NMR信号也用于一个独立的检测通道，以提供场频锁定，以稳定光谱仪，因为现代仪器需要将场频比保持在10⁹分之一以内。通常会在溶剂中加入少量标准物质以提供化学位移参考。四甲基硅烷（TMS）常用于1H、13C和29Si光谱的这一目的 。
定性分析：分子中各个核之间的化学位移差异和核间耦合可用于确定分子中的原子连接。还可以确定观察到的核的数量和化学类型。通常，只有一种结构配置能符合光谱，使其容易区分异构体。还可以确定分子构象和混合物的成分。甚至可以确定对映异构体，如果目标分子与手性溶剂或另一种物质相互作用，形成非对映异构体。可以监测化学反应的方向和程度。可以研究分子中的构型、构象或互变异构的交换速率，只要它们在NMR时间尺度（信号之间的化学位移差异的倒数，以赫兹计）范围内 。
可追溯定量分析：NMR峰下的面积（NMR信号的积分共振强度）与引起共振的核的浓度直接成正比。如果实验进行得当，这个比例常数对光谱中的每个共振都是相同的。因此，通过校正每个共振的峰积分，可以直接确定样品中不同材料的摩尔比。
公式描述了通过QNMR确定相对浓度的方法，其中：( Ct ) 为测试材料的浓度；( Cn ) 为其他材料的浓度；( It ) 为测试材料信号的积分；( Nt ) 为引起测试材料信号的相对核数；( In ) 为其他材料信号的积分；( Nn ) 为引起其他材料信号的相对核数 。
如果光谱中的每个共振都可以解释并分配给特定分子，则可以在不需要标准的情况下确定摩尔纯度，当然，前提是所有杂质都可见：
其中 ( Pt ) 为测试材料的纯度；( It ) 为测试材料信号的积分；( Nt ) 为引起测试材料信号的相对核数；( In ) 为其他信号的积分；( Nn ) 为引起其他信号的相对核数 。
如果知道每种材料的分子质量，则可以通过将摩尔纯度乘以其分子质量并除以各自质量之和，将其转化为更有用的基于质量的纯度。如果无法确定给定混合物的此信息，则可以使用内标法确定绝对纯度，其中将已知量的内标物质加入含有测定物质的溶液中。
其中：( Pt ) 为测试材料的纯度；( Is ) 为内标的积分；( It ) 为测试材料的积分；( Ns ) 为引起内标信号的相对核数；( Nt ) 为引起测试材料信号的相对核数；( Ms ) 为内标的分子质量；( Mt ) 为测试材料的分子质量；( Ws ) 为内标的质量；( Wt ) 为测试材料的质量；( Ps ) 为内标的纯度 。
为了准确进行QNMR测定，必须满足几个关键条件。应优化光谱信噪比和分辨率。为了避免NMR信号的弛豫效应，应知道样品中每个核的T1，并调整RF脉冲宽度或脉冲之间的延迟时间，以确保在采集之间有足够时间进行完全弛豫。由于RF脉冲覆盖的频宽与脉冲宽度成反比，因此应注意确保宽光谱范围的极端核
接收相似的激发强度。由于洛伦兹形状NMR信号的“裙带”延伸到无限远，因此在比较具有非常不同峰宽的峰积分时应小心。1H NMR光谱受质子信号与有机材料中自然存在的1.1%的13C核的耦合信号的影响。这些信号必须一致处理——要么总是与主信号一起积分，要么总是忽略。在高场强下获得的光谱有助于这一点，因为化学位移（以赫兹表示）与体磁场的大小成比例增加，而耦合常数（也以赫兹表示）保持不变。通过旋转样品管引起的调制导致的边带最好通过在非旋转模式下获得光谱并仔细调整磁场均匀性（调整磁场均匀性）以保持分辨率来避免。为获得最佳结果，QNMR中应仅使用最高等级的溶剂，尽管有时可以使用仅包含溶剂的光谱（空白光谱）来校正一些溶剂杂质。样品制备需要谨慎，以避免意外干扰。样品管应清洁，然后用NMR溶剂冲洗，并在140℃下过夜干燥。所有传输工具（移液器、铲子等）必须严格清洁。样品溶液不应在任何时候接触NMR管盖或隔膜，因为仅一次接触就足以从这些材料中提取足够的增塑剂、表面活性剂和其他污染物，使样品对于QNMR无用。同样，触摸移液器或注射器针头时裸手会将可观察到的角鲨烯和身体油的其他成分引入样品。通常的做法是在NMR管中配制分析溶液，这样可以最大限度地减少意外污染。这样做时，如果需要准确称量（例如使用内标法），则应注意避免样品管上的静电荷引起的称量误差。商购的放射源可用于最大限度地减少这种静电效应。然而，称量不确定性可能会主导误差方程。适当内标物质的要求和属性已有详细记录，但从公式（4.5）中可以看出，内标物质的纯度及其不确定性是关键参数。最后，用于定量的NMR信号应不受化学交换的影响。对于1H NMR，这通常意味着避免因氧和氮结合的质子产生的信号 。
使用现代NMR光谱仪，可以常规进行最佳的1H QNMR，检测和定量可达质量分数的0.01%，不确定度（U95）在0.5%到1.0%范围内。在许多情况下，通过花费更多时间进行数据采集，可以将检测和定量限降低一个数量级。具有低温冷却探头和前置放大器的高场强、最先进的光谱仪可以进一步将可用的检测和定量限延长四倍。虽然这些限度不及其他分析技术（如质谱或荧光光谱）的最终灵敏度，但QNMR用于中等痕量水平测定的使用正在增加。NMR与色谱分离技术的结合进一步增加了其实用性 。
一对一为您答疑解惑
