光学与透射电子显微技术：原理、方法与应用解析

在材料科学、生命科学及半导体工业等前沿领域，对微观结构的精准观测是推动技术创新与质量控制的核心。显微分析技术，作为我们探索微观世界的眼睛，其能力边界直接决定了我们的认知深度。本文将系统梳理两大主流显微技术体系——光学显微镜（OM）与透射电子显微镜（TEM），深入剖析其核心原理、关键技术分支及其在实际应用中的独特价值。

一、光学显微镜（OM）：超越衍射极限的探索

尽管光学显微镜的历史悠久，但它在材料微观结构的快速评估中依然扮演着不可或缺的角色。任何光学成像系统都受到一个基本物理限制——波的衍射。即使是完美无像差的透镜，其焦点也会因衍射效应而模糊成一个光斑，这便是衍射极限，它规定了显微镜的理论最高分辨率。

图1：受波动衍射限制的显微镜点分辨率。由于透镜尺寸有限，即使无像差，焦点也会因衍射而模糊。(a)与(b)等效；©定义了点分辨率。

我们将重点探讨三种在现代科研中极具代表性的光学显微技术：干涉显微镜、激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）以及全内反射荧光显微镜（TIRFM）。

图2：各类显微技术的尺度覆盖范围示意图。

1. 干涉显微镜 (Interference Microscopy)

干涉显微镜的核心技术在于利用光的相位信息。当照明光穿过具有不同折射率的透明样品，或从具有高度差的表面反射时，其相位会发生改变。通过将这束光与一束参考光进行干涉，微小的相位差被转换成可观测的干涉条纹。在微分干涉相衬（诺马斯基）显微镜中，两束略微分开的光束发生干涉，能以极高的空间分辨率将相位差转化为颜色差异，从而实现对表面台阶高度的精确测量，精度可达20 nm。

图3：(a) 微分干涉光学（诺马斯基）显微镜原理。(b) 反射波在台阶边缘发生的相移。

2. 激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM)

LSCM是一种扫描型显微镜，它使用激光束作为探测“探针”。其工作原理如图4所示：一束平行激光束经物镜聚焦于样品内的微小点上，散射或荧光信号被同一物镜收集，并再次聚焦到一个共轭位置的出口针孔上。这一设计的精妙之处在于，只有来自焦平面的信号光才能通过共聚焦针孔被探测器接收，而来自非焦平面点的杂散光则被有效滤除，从而极大地提升了图像的信噪比和对比度。通过对样品进行逐点扫描，便可构建出二维或三维高分辨率图像。

一个有趣的事实是，尽管LSCM的点分辨率受限于亚波长级别（数百纳米），但远小于分辨率极限的微小物体，只要能发光或散射光，仍然可以被“看到”——它们会以亮点的形式出现。这意味着，如果分子间的距离足够大，我们甚至可以探测到单个分子的信号。当然，LSCM的扫描成像模式也带来了其主要缺点：图像采集时间较长。

图4：激光扫描共聚焦显微镜工作原理。

3. 全内反射荧光显微镜 (TIRFM)

TIRFM技术利用了光在两种不同折射率介质界面发生全内反射时产生的倏逝波。如图5所示，它通常在普通荧光显微镜的基础上增加一套特殊的照明系统。样品（通常由荧光分子标记）附着在玻璃盖玻片表面，激光以大于全反射临界角入射到玻璃-样品界面。此时，光并不会穿透样品，而是在界面处形成一个强度随距离指数衰减的电磁场——倏逝波。这个场的穿透深度极浅（通常小于一个波长），因此只有紧邻界面的荧光分子被激发。这种表面选择性激发带来了极高的信噪比。通过使用浸没式物镜，TIRFM可以实现高达100倍的放大倍率，并且非常适合在水溶液中对生物分子进行原位（in vivo）研究。相较于LSCM，TIRFM在图像采集速度上具有明显优势。

图5：全内反射荧光显微镜工作原理。

二、透射电子显微镜 (TEM)：深入原子尺度的洞察

电子与固体的相互作用远比光子强烈，这使得它们无法穿透较厚的固体。电子能量损失的机制与其动能相关，如图6所示，在低能区（10-30 eV），电子主要通过激发等离激元而损失能量。随着动能增加，由电子激发主导的吸收截面逐渐减小（除特定元素的芯能级激发边），直至高能区因轫致辐射效应而再次增大。因此，能量高于约100 keV的高能电子能够穿透厚度小于约1 μm的薄样品。

图6：电子吸收截面与电子能量的依赖关系。

如何制备出足够薄的、可供观察的样品，便成为TEM研究的关键挑战。传统方法如化学腐蚀法并非对所有材料都有效。聚焦离子束（FIB）等离子铣削技术的出现，极大地缓解了制样难题，拓宽了TEM的应用范围。

1. 核心功能：成像与衍射的灵活切换

TEM相较于其他显微技术的一大核心优势在于，它能在成像模式与衍射模式之间轻松切换。这意味着研究者可以对样品某一特定微区的形貌进行观察的同时，原位获取其晶体学信息。如图7所示，在成像模式下，物镜在像平面上形成的实空间像被投影到荧光屏上；而在衍射模式下，只需改变中间镜的焦距，物镜后焦平面上的衍射花样就会被投影到屏上。

为了观察样品中的非均匀性，通常在后焦平面插入物镜光阑以选择特定的衍射束。若要获得样品特定区域的衍射信息，则在物镜像平面处插入选区光阑（SAD）。最常见的明场（BF）像，是通过只允许透射束通过物镜光阑形成的，图像整体较亮，衬度由吸收和衍射效应产生。相应地，选择某个衍射束进行成像，则可得到暗场（DF）像，此时产生该衍射的缺陷或晶粒区域在黑暗背景中呈现为亮区。

图7：透射电子显微镜的电子光路示意图：A为衍射模式，B为成像模式。

2. 图像衬度的物理本质：动力学衍射与Pendellösung效应

多数情况下，TEM图像是电子波在晶体样品中衍射后形成的干涉图样。因此，若不结合多种衍射条件下的图像进行仔细比对，就不可能对TEM图像做出正确解读。尽管运动学理论能在直观上解释许多常规TEM图像，但在某些关键情况下，必须考虑动力学效应或多重反射。

如图8所示，当一束电子以布拉格角θ_B入射到一组晶面时，会产生衍射束，而这束衍射束可能被同一组晶面的反面再次反射回透射束方向。在厚晶体中，这个过程会反复进行，能量在透射束和衍射束之间周期性地交换。这一现象被称为Pendellösung效应（摆动效应），因其与双摆的能量交换行为相似而得名。它不仅是TEM中等厚条纹衬度的基础，也同样出现在X射线形貌学中。

图8：透射束与衍射束之间的周期性能量交换。(a) 运动学情况；(b) 动力学情况。

当仅激发一个衍射束 g 时，透射束强度 I₀ 和衍射束强度 I_g 随样品厚度 t 的变化由下式给出：

I₀ = cos²(πs_efft) + [(s_effξ_g)² - 1] * (πt/ξ_g)² * [sin²(πs_efft) / (πs_efft)²]

I_g = (πt/ξ_g)² * [sin²(πs_efft) / (πs_efft)²]

其中，ξ_g 被称为消光距离，它与晶胞体积、布拉格角、电子波长和结构因子相关。s_eff 是一个与偏离布拉格条件的程度 s 和消光距离相关的参数。在动力学条件下（|ξ_g|^-1 >> |s| ≈ 0），透射束和衍射束的强度以消光距离 ξ_g 为周期交替变化。

Pendellösung效应的物理根源在于布洛赫波。在布拉格衍射条件下，电子波在晶体中以两种布洛赫波的形式传播。如图9所示，一种波（a）的振幅位于原子列之间，与原子的相互作用较弱，因而被吸收得较少；另一种波（b）的振幅则位于原子列上，相互作用强，被吸收得也更多。这种差异导致了电子的反常吸收（Anomalous Absorption）和反常透射（Anomalous Transmission）效应，是理解菊池线和电子通道效应等现象的基础。

图9：两种色散分支上的布洛赫波。(a)波吸收较少，(b)波吸收较多。

3. 高分辨透射电子显微镜 (HRTEM)

对于能量约100 keV的电子，其埃瓦尔德球曲率半径远大于倒易点阵的间距。更重要的是，由于TEM样品极薄（通常<100 nm），其倒易点阵在垂直于样品表面方向上被拉长成“倒易杆”。如图10所示，这使得埃瓦尔德球可以同时与多个倒易杆相交，即同时激发多个衍射束。

图10：TEM中电子衍射的埃瓦尔德球构图。薄样品的倒易阵点沿表面法线方向伸长，使得多个衍射可被同时激发。

这正是高分辨透射电子显微镜（HRTEM）的物理基础。通过收集包括大衍射矢量 g 在内的多个衍射束进行干涉成像，可以获得包含样品微小尺度结构信息的高分辨率图像。在特定的欠焦条件——即Scherzer欠焦下，HRTEM图像可以近似地看作是电子束入射方向上原子列的投影图（图11）。

图11：高分辨TEM原理。(a) 电子束沿晶体特定轴向入射。(b) 收集多个衍射束形成的高分辨像，在Scherzer欠焦条件下可近似为原子列的投影。

然而，HRTEM图像的解读极其复杂。图像衬度对物镜欠焦量、样品厚度以及缺陷在样品中的深度位置都极为敏感。要获得真实的原子排布结构，必须将不同欠焦条件下拍摄的实验图像与基于动力学理论的模型结构模拟图像进行精细比对。常规HRTEM的点分辨率约为0.2 nm。因此，要获得一张信噪比高、结果可靠的图谱，对样品制备、设备参数配置和数据解译都有极高要求。这正是专业检测实验室的核心价值所在。

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三、各类显微技术核心参数对比

为了更直观地比较上述及其他常用显微技术，下表总结了它们的核心参数。

表1：各类显微技术对比

注：a - 表示该值依赖于具体材料和实验条件。